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脫色搖床對內皮間質轉化的影響中的使用

返回列表 來源:未知 發布日期:2019-08-02 14:59【

廣義的硬皮病包括由增厚、硬化的皮膚損傷所 引起的一系列異質性疾病,根據是否存在系統受 累,可將其分為局灶性硬皮病和系統性硬皮病( systemic scleroderma,SSc) 。其中 SSc 病因復雜,以 皮膚、內臟纖維化為主要特征,其致病機制主要歸結 于自身免疫紊亂、血管損傷與成纖維細胞活化并過 度表達等方面。內皮間質轉化是指在各種因素影響 下,內皮細胞向間質細胞轉化,獲得成纖維細胞特性 的轉化過程,內皮間質轉化在纖維化、動脈粥樣 硬化和腫瘤等疾病的發展中起著重要作用。內 皮間質轉化參與 SSc 發病,是 SSc 纖維化過程的重 要始發因素。因此,通過研究尋找能延緩甚至逆 轉內皮間質轉化發生、發展的有效藥物,可能為防治 SSc 提供潛在治療藥物。轉化生長因子-β1 ( transforming growth factor-β1,TGF-β1) 是誘導內皮間質 轉化發生的關鍵細胞因子之一。研究表明,在 SSc 的發病機制中,被 THBS、纖維蛋白溶酶等激活后, TGF-β1 可調控復雜的細胞信號反應從而介導 EnMT 過程,導致細胞表達間質細胞抗原。補腎益 精法是鄧鐵濤教授運用“肺脾腎相關辨治硬皮病” 理論,結合嶺南獨特的地理環境所擬定的中醫特色 治法。本課題組前期研究顯示,補腎益精中藥復 方在體內外具有抗 SSc 皮膚纖維化的效果,但復 方是否為通過抑制內皮間質轉化的機制抗皮膚纖維 化尚不明確。因此,本研究將探討補腎益精中藥復 方對 TGF-β1 誘導的內皮間質轉化模型的作用及機 制,為臨床早期干預 SSc 提供有力證據。



1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 實驗動物及細胞


20 只雄性 SD 大鼠,6 ~ 8周齡,體質量( 190 ± 5) g,SPF 級,購于中山大學實驗 動物中 心,許 可 證 號: SCXK ( 粵) 2016-0029。HUVEC 購于中山大學實驗動物中心細胞庫。HUVEC 培養: 培養基為 DMEM-H,10% FBS,1% P /S,pH = 7. 0 ~ 7. 5,于 37 ℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養。



1. 1. 2 實驗試劑

黃芪甲苷購于廣州市藥品檢驗 所; 0. 25% Trypsin-EDTA( 1X) ( GIBCO 15090-046) 、 PBS pH 7. 4 basic ( 1X) ( GIBCO C10010500BT) 、 TGF-β1( PeproTech,96-AF-100-21C-10) 、Trizol( MRC TR118-500) 、M-MLV Reverse Transcriptase( Promega, M1705) 、GoTaq  qPCR Master Mix ( Promega, A6002) 。



1. 1. 3 實驗儀器

電子天平( 上海精密科學儀器, JA1003N) ,基 因 擴 增 儀 ( Hema,Hema9600 ) 、Realtime Quantitative PCR( Bio-Rad,MiniOpticon) ,電泳 儀( TanonEPS 200) ,TS-2000A 脫色搖床( 海門市其林貝爾儀器制造有限公司 TS-2000A ) ,正置光學顯 微鏡 ( 日 本 尼 康 NIKONECLIPSEE100 ) 、成像系統( 日本尼康 NIKONDS-U3) 。



1. 2 實驗方法

1. 2. 1 TGF-β1 誘導


HUVEC 細胞建立內皮間質 轉化模型 復蘇 HUVEC 細胞株,以 10% FBS 的培 養基,在 37 ℃、5% CO2 條件下培養細胞,細胞消化 傳代后,接種 6 孔板,37 ℃、5% CO2 培養箱中過夜, 第 2 天吸去培養基,PBS 洗兩遍,每孔加入 1. 5 mL 10 μg·L - 1 TGF-β1 的基礎培養基,繼續培養 48 h。



1. 2. 2 設計

Fli1 siRNA 序列及細胞轉染 設計 Fli1siRNA 序列,吉瑪基因進行合成 Fli1 siRNA-1、 Fli1 siRNA-2,然后分別進行細胞轉染,48 h 后收集樣本進行 QPCR 實驗。



1. 2. 3 藥物、含藥血清的制備

藥物制備: 補腎益 精法方藥購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院,阿膠 10 g,山萸肉 10 g,熟地黃 20 g,黃芪 30 g,懷山藥 30 g,茯苓 15 g,川紅花 5 g,加蒸餾水 1 200 mL。浸 泡 20 min 后,沸煮45 min,過濾收集藥液。100 ℃水 浴蒸發使藥液濃縮至 134 mL ( 相當于含生藥量 0. 9 g·mL - 1 ) 。 含藥血清的制備: 給藥組藥量按照 SD 大鼠實 際體質量計算,每 100 g 體質量給予生藥量 1. 8 g 的 補腎益精中藥復方; 對照血清組按等體積灌胃生理 鹽水溶液。每天給藥 2 次,連續 3 d。末次給藥 3 h 后,嚴格無菌條件下由心臟 內采血,以 2 500 r·min - 1 離心 15 min,離心半徑 12 cm,分離血清, 保存于 - 80 ℃冰箱備用。



1. 2. 4 實驗分組及干預

對照血清組: 細胞培養基 中加入 10% 對照血清; 內皮間質轉化模型組: 細胞 培養基中加入 10 μg·L - 1 TGF-β1 和 10% 對照血 清; 含藥血清組: 細胞培養 基 中 加 入 10 μg ·L - 1 TGF-β1 和 10% 含藥血清; 黃芪甲苷組: 細胞培養基 中加入 10 μg·L - 1 TGF-β1 和 30 μmol·L - 1 黃芪甲 苷; Fli1 siRNA + 含藥血清組: 細胞培養基中加入 10 μg·L - 1 TGF-β1 和10% 含藥血清和200 μmol·L - 1 Fli1 siRNA。均處理 48 h。



1. 3 觀察指標及方法

1. 3. 1 顯微鏡檢測


HUVEC 細胞內皮間質轉化過 程 10 μg·L - 1 TGF-β1 誘導 HUVEC 細胞 48 h 后, 顯微鏡下觀察細胞形態變化。



1. 3. 2 QPCR法檢測

各 組 Fli1、VE-cadherin、 FSP1 的表達情況 6 孔板細胞 PBS 沖洗后加入 1 mL Trizol,吹打后收集到 EP 管內; 離心 15 min,取上 清。組織處理: 取組織于預冷的研缽中,加入液氮研 磨至粉末狀,收集到 EP 管內加入 1 mL Trizol,反復 吹打; 離心 15 min,12 000 × g,取上清。向上清液中 加入 200 μL 氯仿,混勻靜置 3 min。12 000 × g 離心 15 min 后取上清 500 μL 到新的 EP 管內; 加入等體 積的異丙醇,混勻靜置 10 min 后,4 ℃ 12 000 × g 離 心 10 min 后去上清液,加入 1 mL 75% 乙醇,上下顛 倒,使沉淀塊重懸起。4 ℃ 12 000 × g 離心 10 min 后去掉上清液。晾干至管壁無液體。加入適量的 DEPC 水溶解 RNA,58 ℃水浴后取出 2 μL 定量,測 量 buffer: 10 mmol·L - 1 TrisCl( pH 7. 8) ,根據定量結果進行逆轉錄。



1. 4 統計學方法

采用 SPSS 24. 0 統計軟件包進 行實驗數據分析,計量資料以均數 ± 標準差( x珋± s) 表示,組間比較采用 t 檢驗。P < 0. 05 為差異有統 計學意義。



2 結果

2. 1 TGF-β1 對 HUVEC 細胞形態的影響


TGFβ1 誘導 HUVEC 細胞 48 h 后,顯微鏡下觀察細胞形 態變化,可見誘導后的細胞呈多角形或梭形,提示內 皮間質轉化模型構建成功。見圖 1。




2. 2 各組細胞


Fli1、VE-cadherin、FSP1 mRNA 表 達比較 TGF-β1 誘導 HUVEC 細胞后,QPCR 法檢 測 Fli1、VE-cadherin、FSP1 的表達,發現模型組內皮 標志物 VE-cadherin 表達降低( P < 0. 01) ,間質標志 FSP1 表達升高( P < 0. 01) ,提示 TGF-β1 誘導內皮 間質轉化模型建模成功; 同時模型組 Fli1 表達低于 對照組( P < 0. 05) 。見表 1。





3 討論


SSc 發病機制主要歸結于免疫異常、纖維化與 血管異常三大方面。SSc 常伴不同程度血管損害的 表現,如雷諾現象、指尖潰瘍等,且雷諾現象常為本 病首發現象,提示血管損害常出現在早期,是本病發 病的基礎環節。研究顯示,內皮間質轉化參與硬皮病的發生發展。SSc 血管周圍微環境可引起血 管內皮細胞的損傷,內皮間質轉化,肌成纖維細胞數 量增加,內皮間質轉化過程中內皮細胞的生物學 特性顯著變化,細胞獲得強大的增殖、遷移和收縮能 力。此過程中內皮細胞失去 VE-cadherin 等特異 性內皮細胞標記物,同時獲得如 FSP1 間質細胞標 志物。內皮間質轉化與多條通路的介導有關,其 中最重要的是 TGF-β 通路。TGF-β1 是早期啟動 SSc 組織纖維化的重要因子,可促進多種細胞外基 質的表達。因此,對 TGF-β1 通路的干預已經成為 硬皮病治療的重要靶點。







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